凝结魏茨曼氏菌BC66检测方法操作指南
凝结魏茨曼氏菌
凝结魏茨曼氏菌（原凝结芽孢杆菌），革兰氏阳性杆菌，分类学上属于硬壁菌门芽孢杆菌属。其细胞呈杆状，端生芽孢，无鞭毛，能分解糖类生成 L-乳酸。
仪器与设备
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：天平、pH计、拍击式均质器及无菌均质袋、涡旋振荡器、恒温水浴锅、恒温培养箱、容量瓶、烧杯、量筒、无菌锥形瓶、无菌试管、微量移液器及无菌吸头、无菌培养皿。
培养基与试剂
1.生理盐水
称取9.0g氯化钠，蒸馏水充分溶解后，定容至1000 mL，用玻璃试管分装，121 ℃高压灭菌15~20 min。（注：用于试样制备溶解样品时应按比例添加0.5%吐温-80。）
2.琼脂培养基
葡萄糖5.0g、蛋白胨10.0g、酵母粉5.0g、牛肉膏5.0g、氯化钠0.25g、无水氯化钙0.15g、一水合硫酸锰0.1g、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g、琼脂粉15.0g，加入1000 mL蒸馏水，调节pH至5.0~5.5，加热溶解，分装至锥形瓶中，121 ℃高压灭菌15~20 min。
检测步骤
1.样品稀释
以无菌操作称取1g凝结魏茨曼氏菌，置于装有99ml无菌生理盐水无菌均质袋中。将无菌均质袋在拍击式均质器中以10次/秒均质5~10min，直至样品分散均匀，制备样品匀液。
用微量移液器吸取样品匀液1.0mL，垂直注于装有9.0mL生理盐水的无菌试管中（注意吸管尖端不要触及稀释液），通过涡旋振荡器混匀（振荡10~15s），制成10倍稀释的样品匀液；按上述操作顺序，做10倍递增稀释，每递增稀释一次，更换无菌吸头。
根据样品总数进行估计，选择2～3个连续适宜稀释度的试管，置于80℃恒温水浴锅中水浴10min，水浴期间手动振摇试管2~3次样品均匀受热。
2.平板培养
每个稀释度试管分别吸取1.0mL样品匀液于两个无菌平皿内，同时分别吸取1.0mL空白稀释液加入两个无菌平皿内作空白对照。将冷却至50℃的琼脂培养基倾注至无菌平皿中，顺时针或逆时针转动无菌平皿至少20次使其混合均匀，待琼脂凝固后，将平板翻转，40±2 ℃需氧培养48±2h。
（注：从样品梯度稀释到平板倾注要求在30min内完成。）
结果计算
选取菌落数在30～300CFU之间、无蔓延菌落生长的平板计算凝结魏茨曼氏菌菌落总数，每个稀释度的菌落数应采用两个平板的平均数。
若只有一个稀释度平板上的菌落数在适宜计数范围内，计算两个平板菌落数的平均值，再将平均值乘以相应稀释倍数，作为每克样品中的菌落总数结果。
若有两个连续稀释度的平板菌落数在适宜计数范围内时，按如下公式计算：
式中：
N——样品中凝结魏茨曼氏菌菌数，以芽孢计
∑C——平板（含适宜范围菌落数的平板）菌落数之和
n1——第一稀释度（低稀释倍数）平板个数
n2——第二稀释度（高稀释倍数）平板个数
d——稀释因子（第一稀释度）
示例：若第一稀释度（10-5）经确证后的菌落数为262和215，第二稀释度（10-6）经确证后的菌落数为43和35，则按照上述公式计算结果为：
凝结魏茨曼氏菌总数计数结果报告以科学计数法（保留两位有效数字）形式表示，报告单位为CFU/g或CFU/mL。
特征与鉴别
菌落圆形，表面光滑，白色而有光泽，属于芽孢杆菌科，革兰氏阳性兼性厌氧杆菌，芽孢中生到次端生，孢子椭圆或柱状，孢囊膨大或不明显膨大，产L(+)-乳酸的细菌。
（左图为凝结魏茨曼氏菌菌落形态；右图为凝结魏茨曼氏菌显微镜下形态）
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